大球盖菇菌种生产方法和蘑菇、草菇菌种生产方法基本相同，可用组织分离法和孢子分离法获得纯菌种，新区主要靠引进母种或原种。适合大球盖菇母种生产的培养基如下：
1.母种培养基
(1)麦芽糖酵母琼脂培养基(MYA)大豆蛋白胨(豆胨)1克、酵母2克、麦芽糖20克、琼脂20克，加水至1000毫升。
(2)马铃薯葡萄糖酵母琼脂培养基(PDYA)马铃薯300克(加水1 500毫升，煮20分钟，用滤汁)、酵母2克、豆胨1克、葡萄糖10克、琼脂20克，加水至1000毫升。
(3)燕麦粉麦芽糖酵母琼脂培养基(DMYA)燕麦粉80克、麦芽糖10克、酵母2克、琼脂20克，加水至1000毫升。
上述3种配方中如不加琼脂，即可作为液体培养基。以上培养基需按常规配制、分装、灭菌、接种和培养。
2.原种和栽培种培养基
(1)小麦秆或裸麦秆，切碎(长2～3厘米)，泡湿，装瓶,高压灭菌后备用。
(2)小麦、裸麦，高粱、玉米、小米等谷粒浸泡，煮透至没有白芯但表皮不破，加2%碳酸钙，装瓶，高压灭菌后备用。
(3)木屑和小木片各40%、麸皮20%，制作栽培种培养基。
还可用平菇或金针菇下脚料作培养基重新灭菌后备用。
3.接种
可以用培养3～4天的液体菌种接种。若用固体菌种必须加大接种量(菌种／培养料)，接种量最少10%，最好15%～20%。
